[illumina] Sequence library의 구성 (primer, index, oligo)

Sequencing에서 가장 먼저 해야하는 일은 DNA나 RNA로부터 library를 제작하는 일이다. 마이크로바이옴 분야에서 amplicon sequencing library가 어떻게 제작되고 구성은 어떤지 확인하였다.

https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf

overhang adapter sequence(non-biological sequence)와 locus‐specific sequence(biological sequence, 341F/805R 등)가 연결된 primer를 PCR에 사용하여 원하는 부위를 증폭(amplification)하고 library를 만든다 (3).

 

제작된 Dual-indexed library의 구성은 다음과 같다 (1).

https://support.illumina.com/bulletins/2020/06/illumina-adapter-portfolio.html

• Rd1 SP, Rd2 SP: Sequencing을 위한 sequencing primers의 binding site 1, 2에 해당한다.
• Index 1, Index 2: 3’, 5’ 쪽인지 구분할 수 있다.
• P5, P7: flow cell에 붙게 해주는 linker sequence이다 (region complementary to flow cell).

이들을 통칭해서 adaptor sequence라고 부른다. 이 library를 sequencing하여 우리가 관심 있는 DNA insert의 sequence를 알아낼 수 있다 (위 과정을 거쳐 sequencing이 완료되면 locus‐specific sequence는 raw data에서 확인 가능할 것으로 생각된다).

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한편, sample barcodes라는 용어도 있다. 아래 그림과 같이 여러 개의 샘플을 합쳐서 (pooling samples) 한번에 분석하는 과정을 sample multiplexing (multiplex sequencing)이라고 한다. 여러 번 시퀀싱 기기를 돌릴 것을 한번만 하면 되기 때문에 비용과 시간이 절감된다. 이 과정에서 샘플들을 구분하기 위해 사용되는 것이 sample barcodes이다 (2).

https://www.illumina.com/techniques/sequencing/ngs-library-prep/multiplexing.html

 

Sample barcodes는 따로 있는 것이 아니라, 위의 index 1, index 2가 그 역할(sample identifiers)을 할 수 있다. Dual indexing strategy는 8 base의 Index 1 (i7)과 Index 2 (i5)을 사용하는 것으로, Index 1은 12개, Index 2는 8개의 서로 다른 sequence를 가질 수 있다. 그래서 최대 96개(12*8)의 샘플을 구분할 수 있다 (3).

 

 

Reference

1. https://support.illumina.com/bulletins/2020/06/illumina-adapter-portfolio.html
2. https://www.illumina.com/techniques/sequencing/ngs-library-prep/multiplexing.html
3. https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf